基因治疗小圆桌：生物制品外源病毒检测方法简介

生物制品制备过程使用的各种原辅材料来源复杂，且制品组分一般不能采用苛刻的终端理化处理。这些特殊性使外源因子(extraneous agents, EA) 特别是潜在的病毒污染成为生物制品质量控制中的挑战。

外源病毒污染不仅会给产品的预防及治疗效果造成影响，还可能对生物制品的生产环境和操作者带来潜在污染与健康风险。因此，生物制品中的外源病毒污染一直是监管机构对其安全性评价的重要方面。

目前常用的检测方法有体外细胞培养、接种动物、种属特异性检查等传统方法，2022年9月29日国际人用药品注册技术协调会（ICH）签署了生物技术产品的病毒安全性评价指导原则的最新草案（Draft）ICH Q5A (R2)，对推荐的外源性病毒检测和鉴定方法作了明确的补充，新增 “3.2.5 分子生物学方法，分子生物学方法可用于补充或替代基于体外细胞培养试验和体内动物试验。包括核酸扩增技术和下一代测序技术。”

1、传统检测方法

传统检测外源病毒的方法主要有血吸附检查法、细胞培养法、鸡胚检查法和实验动物抗体检测法。目前, 传统的检测法已经成为广泛筛查外源病毒的标准方法。细胞培养在病毒检测中具有核心地位, 大大方便了下游实验室分析。但是, 许多潜在外源致病因子不能在细胞上复制, 或者没有建立合适的动物模型, 使得传统检测方法受到严重束缚。

2、常规PCR检测方法

核酸检测方法非常敏感, 能检测到未出现发病症状时的少量病毒, 但需要先知道待检测病毒的核酸序列。此外, 因为PCR等分子检验技术只能检测核酸, 不能证明是否感染, 对于PCR阳性结果的解释较为复杂, 经常需要进一步检测。

3、实时荧光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR, qPCR）法

作为正在兴起的分子检测技术，qPCR法在内外源病毒检测上能弥补体内外培养法和常规PCR法的不足，其应用备受关注并在生物制品质控中的应用范围越来越广。qPCR法用于外源病毒污染检测，首先是在病毒数据库中筛选出高频发生且带来一定危害的污染病毒，然后在筛选出的病毒基因组或转录组上设计特异性高的引物与荧光探针，通过后续PCR扩增中的荧光信号值进行实时检测，同时在扩增系统中加入内参和阴阳性质控品对检测试剂、交叉污染等进行监控并做为对照，通过模板Ct值与起始拷贝数的线性关系进行定性和定量分析。

4、电镜观察法

透射电子显微镜（TEM）可用于通过可视化和量化生物体液或细胞内的病毒颗粒来确定病毒载量。此外，它是根据病毒样颗粒的大小和形态特征对其进行表征的有用工具。监管机构目前建TEM用于：病毒或病毒样颗粒的定量检测，以及病毒、细胞系或载体鉴定。尽管TEM法可清晰直观地呈现病毒的特征，但对病毒纯度要求高，检测下限有限，同时易被其它物质干扰。

5、二代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）法

种属特异性病毒检测是针对特定的病毒核酸序列或病毒产生的特异性抗体进行的检测，无法检测未知病毒。因此，检测生物制品中的外源病毒需要更先进且全面的检测方法。

NGS（Next Generation Sequencing, NGS），也称大规模平行测序（massive parallel analysis, MPS），是一种可以在较短时间内一次测定大量核苷酸序列的技术。不同于其他检测外源病毒的方法，NGS是一项非常复杂的技术，通常NGS法检测外源病毒的流程包括样本收集、去除宿主核酸、病毒核酸提取、病毒全基因组扩增、文库构建、测序、生物信息学分析和对阳性信号的深度调查等多项技术配合完成，各环节都需要严格设计施行以充分提高检出病毒的灵敏度和特异性。NGS法检测生物制品中的外源病毒主要面临三个方面的挑战：检测体系的标准化、生物信息学分析的合理化及建立阳性信号的后续分析策略。

NGS技术检测生物制品中的外源病毒尚处于早期研究阶段。目前，欧洲药典和WHO推荐使用NGS作为可供选择的方法或替换方法，特别是取代动物体内试验；虽然U.S.FDA没有特别推荐NGS技术，但其指导原则允许使用其他可供选择的方法和新方法；然而，日本和我国药典还未强调NGS在该领域的使用。

病毒污染是威胁治疗用生物制品用药安全的重要风险，病毒污染恶性事件在历史上多次发。随着人类对病毒认知的提高，检测技术进步和病毒去除及灭活技术的开发运用，病毒安全得以提高。但研究发现，不同方法鉴定、检测病毒的结果并不一致。因此，生物制品中病毒污染检测不能仅依靠上述提到的某一种方法单独进行，应结合品种特点和具体生产情况综合分析，设计并选择适宜的方法对潜在污染病毒进行检测。

控制生物制品的潜在病毒污染，主要依据以下原则：

• 选择并对选定的细胞系和其他原料进行检定，确保其不含可能对人有感染和（或）致病作用的病毒。

• 评估生产工艺清除感染性病毒的能力。

• 检测生产适当步骤的产品，确保产品未受感染性病毒的污染。

同时，在产品纯化过程中，加入去除/灭活病毒工艺也是必须的。

随着科技的进步，可能会有更多未知的外源因子被发现。对于一些新的生产体系，如新的生产细胞、新的包装病毒和辅助病毒等，由于对细胞的内/外源病毒污染背景不清晰，对包装病毒和/或辅助病毒对人体细胞的感染性和致病性不明，此时往往需要进行更多的探索研究和更严格的风险控制策略。

为更好控制和防范外源因子的污染，生产企业需进一步加强对生物活性原材料的质量控制、建立良好的生产用细胞库和菌毒种库体系，严格按照GMP管理规范组织生产。同时，提高生产和质量控制人员的技术水平也是提高制品安全性的重要且必要的环节。

相关法规指南

随着生物制品上市数量的增加，各国药品监管机构也越来越重视病毒污染存在的安全风险问题。近年来陆续发布相关技术法规和技术指南，旨在提高对病毒污染风险意识、加强控制措施，严格病毒筛查、完善生产工艺、规范生产操作、防止生产过程中外源病毒的引入，确保产品的安全。

2020年7月份颁布的《中华人民共和国药典(2020年版)》，在三部生物制品中首次增加了一个独立的章节-《生物制品病毒安全性控制》，目的都是希望提高对病毒污染风险意识、加强控制措施，防止生产过程中外源病毒的引入，从而确保临床药品的安全。

参考文献：

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南京贝思奥 (BIONCE) 生物科技有限公司成立于2020年，公司致力于基于重组病毒的基因治疗药物的研发、生产与质量控制，并研制具有自主知识产权的临床基因治疗药物。主要用于治疗眼科疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、罕见病等，打造基因治疗技术研发创新基地。