眼科小课堂：视网膜病变基因治疗中不同注射方式的简介

截至2023年底，世界范围内已开展约380项腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体的基因治疗临床试验，其中眼科相关的项目占比最多，高达25.1%，随着先天性黒朦症2型（LCA2）基因治疗药物Luxturna 经美国食品药品监督管理局批准上市，眼科学基因治疗的发展更加迅速，基因治疗的策略也越来越多，包括基因替代、基因编辑、RNA调控和光遗传学技术等；载体设计逐渐优化，而基因治疗的注射方式也逐渐由视网膜下注射延伸到玻璃体腔注射和脉络膜上腔注射，局部注射避免了全身给药的风险，并使药物针对特定的靶细胞发挥作用，通过不同给药方式进行给药获得的疗效、免疫反应均有所不同，仍需要更进一步的研究，本文将对视网膜病变基因治疗三种给药方式进行介绍。

视网膜下腔（subretinal, SR）位于神经上皮层和色素上皮层之间，构成了血⁃视网膜屏障，可阻止视网膜血管和脉络膜血管内的物质进入视网膜，具有免疫豁免效应，还可通过激活辅助型T细胞2来抑制免疫反应，这种有利的免疫状态促进了SR注射在视网膜基因治疗中的应用。

SR注射是在已有的视网膜下手术的基础上建立的。基因治疗采用的SR注射步骤主要由3部分组成：（1）经睫状体平坦部玻璃体切割术；（2）制作视网膜下平衡盐溶水泡；（3）基因治疗药物注射至视网膜下水泡。

 LCA2的治疗药物Luxturna 即采用此种注射途径，临床试验结果证明药物经SR注射后疗效稳定。目前，采用SR注射的病变主要是由外层视网膜（光感受器） （photoreceptors, PRs）或视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞）或脉络膜特定基因突变造成的遗传性视网膜疾病，SR注射已用于各种视网膜病变的基因治疗研究，结果显示其可有效转导外层视网膜（见表1）。

IVT注射是眼科常用的眼内药物注射途径，操作简单，常用于治疗新生血管性视网膜病变。与SR注射相比，能够保护视网膜不受玻璃体切除术和视网膜穿刺造成的机械性损伤，且药物经IVT注射给药后在玻璃体腔扩散，可弥散至整个视网膜，更倾向于转导内层视网膜细胞，如视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells, RGCs）和双极细胞。 

目前还没有足够的临床证据表明IVT注射AAV载体能以足够的水平转导外层视网膜细胞（PRs/RPE）来达到治疗效果。因此，目前证明IVT注射生物活性的临床试验主要以视网膜RGCs为靶细胞，使RGCs直接受益［如Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）]或利用它们作为特定蛋白的分泌细胞（如抗VEGF抗体）。

有研究表明经IVT注射给药后，可以维持最佳矫正视力（BC-VA），视网膜中央厚度不变或降低，且效果持续达15个月。此外，LHON、XLRS和糖尿病性黄斑水肿（Diabetic macular edema, DME）等采用IVT 注射给药的基因治疗已进入临床试验阶段，反义寡核苷酸治疗RP、LCA和Usher综合征的临床试验均采用了IVT注射的方式（见表2）。

脉络膜上腔（Suprachoroidal space, SCS）是位于脉络膜和巩膜之间的潜在间隙，SCS 注射是一种新兴的眼内注射方式，可通过3种不同的器械完成，包括微导管、皮下针和微针。

利用微导管给药需切开巩膜，经切口插入导管进入脉络膜上腔并向后推进至后极部，在导管尖端照明指引下可在特定部位进行注药，缺点在于具有一定的侵入性；皮下针技术是将皮下针连接到汉密尔顿注射器或胰岛素注射器，将针斜穿过巩膜，推动柱塞使针头逐渐推进，当阻力刚好消失时，缓慢注射，该操作插入深度和角度难以控制，可能会穿透脉络膜和视网膜，造成无意识的玻璃体腔或视网膜下注射； 微针是一种短针，长度只够刺穿巩膜而无法穿透视网膜，垂直插入即可控制针头到达SCS。

已有一项治疗葡萄膜炎继发黄斑水肿的3期临床试验采用SCS注射曲安奈德，结果证明经SCS注射治疗有效且未出现严重不良反应，为SCS注射在基因治疗中的应用奠定了基础。REGENXBIO公司的基因治疗药物RGX-314现已进入2期临床试验（NCT04514653和NCT04567550），将携带抗VEGF 抗体编码基因的AAV8载体经SCS注射，旨在评估其治疗nAMD和DME患者的安全性和有效性（见表3）。

SR注射、IVT注射、SCS注射三种给药方式的侵入性、转导效率和范围、豁免状态、免疫反应均有所不同，适合的视网膜病变和最终能达到的临床效果也有所差异（见表4）。

临床前和临床研究证明，SR注射转导外层视网膜的效率高，可使局部的光感受器或RPE细胞出现转基因高表达，而且具备免疫豁免效应，不会造成明显的局部或全身炎症反应，但该途径侵入性大，需在手术室行玻璃体切除术和视网膜穿刺，伴随有视网膜脱离和白内障等手术风险，且表达范围比较局限；IVT注射是常用的眼内药物注射途径，侵入性小，还可使载体弥散至整个视网膜，由于内界膜的限制，主要转导内层视网膜细胞，但其转导率较低，免疫豁免效应相对较弱，可能会产生较高水平的中和性抗体；SCS注射作为一种新型的眼内注射途径，侵入性低，能够实现外层视网膜细胞大面积转导，且转导效果与ＳＲ 注射相当，体液免疫反应相对较低，但脉络膜上腔位于血⁃视网膜屏障以外，不具备免疫豁免效应，转基因表达时间较短，可能造成较强的局部炎症细胞浸润。 

三种注射方式各有优势和缺点，操作方法、疗效和免疫反应等是临床工作中应用不同注射方式需要重点考虑的因素。

根据不同给药方式的特点，每种给药方式适用于不同的病变，SR注射可能对PRs和RPE最有效，因其表达范围较局限，更适用于影响黄斑的病变；脉络膜上腔注射可广泛转导外层视网膜，且注射点主要在睫状体平坦部，更适合视网膜周边退变的病变，如RP或其他视杆视锥营养不良早期病变的治疗；而玻璃体腔注射可能更适合转导视网膜神经节细胞或双极细胞，可以治疗内层视网膜病变或通过内层视网膜细胞分泌特定蛋白发挥作用，如Leber遗传性视神经病变、X连锁视网膜劈裂或新生血管性视网膜病变等。

目前，SR注射和IVT注射已在视网膜基因治疗中应用并进行了评估，安全性和有效性均取得了一定的进展，SCS注射属于新型的注射技术，为非手术途径实现外层视网膜广泛表达转基因提供了可能，但SCS注射在基因治疗领域的安全性、持久性和有效性等还需进一步研究。随着各种基因治疗技术的不断进展，基因治疗有可能成为视网膜疾病的常规治疗方法，但提升其转导效果和降低注射后的免疫反应仍然是当下和未来研究需要克服的重要挑战。

参考文献： 

周玲玲,沈吟.视网膜病变基因治疗中不同注射方式的应用[J].临床眼科杂志,2023,31(06):571-577.