基因治疗小圆桌：不同质谱检测方法在AAV质量属性检测上的应用简介

前言

目前，质谱（Mass Spectrometry,MS）法在生物制药和蛋白质等大分子分析上已经得到了广泛的应用。在生物制剂检测方面主要涉及氨基酸序列、糖基化、二硫键和翻译后修饰（Protein translational modifications，PTMs）的表征，以及蛋白质鉴定、表位定位、高阶结构测定、宿主细胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）监测及蛋白质定量质量控制测试。随着科学不断地发展，MS与多种技术联用使得质谱可以表征蛋白质的结构和相互作用，例如化学交联结合质谱技术(chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry)，简称交联质谱技术（CXMS或XL-MS），可以用于研究近端残基的相互作用，推断或者验证蛋白质的3D结构。氢氘交换质谱（Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS）、羟基自由基蛋白质足迹（HRPF）或有有限蛋白水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）可用于识别在复合物形成时表面可及性发生改变的残基，从而提供分子间互作界面和复合物构象动力学的信息。而热蛋白质组分析（MS-CETSA）可以用于研究小分子配体的结合程度。

本文主要介绍现有质谱方法在AAV载体制剂的衣壳比率、翻译后修饰、AAV血清型表征和空白衣壳比率上的应用。

衣壳比率

目前用于检测衣壳比率的常用方法为凝胶电泳法，但是固有的伪影、染色差异以及染色的条带强度与衣壳蛋白之间关系尚未阐明限制了该方法的准确性。

有研究报道液相色谱-紫外-质谱联用（LC-UV-MS）检测AAV衣壳蛋白VP3变体，其结果表明LC-UV-MS不仅能进行VP的定量，而且还可以明确地鉴定所有VP成分的氨基酸长度。

亲水作用色谱（HILIC）可以分离出AAV衣壳不同VP的蛋白形态，可用于半定量比较不同批次或工艺中3个VP的相对表达量，并且可以用于AAV不同批次间的比较。

非变性质谱（native MS）可以确定完整大分子复合物的质量、化学计量、组分之间的直接相互作用，并且在多亚基组装的情况下，识别稳定的亚配合物并分配亚基的相对位置，其分析的结果与LC-UV-MS检测的结果基本一致。

翻译后修饰（PTMs）

有学者用反相液相色谱-质谱联用（RPLC-MS）对AAV的衣壳蛋白进行分析，检测到了包括N-乙酰化、脱酰胺化、氧化、甲基化和磷酸化在内的多种PTMs，证明RPLC-MS联用可以用于分析AAV衣壳蛋白的翻译后修饰。

除此之外，基于PTMs的研究结果，通过蛋白质工程来设计改善AAV衣壳蛋白，可以使得AAV的转导效率得到提高，半衰期得到延长。

不同批次AAV8之间的PTMs

血清型的鉴定

AAV血清型鉴定通常通过酶联免疫吸附试验(ELISA)或Western blot方法进行。然而，这些方法受到血清型特异性抗体可用性的限制，可能不足以区分具有高序列同源性的血清型，这一问题将不可避免地因工程化AAV血清型数量的迅速增长而复杂化。

基于质谱(MS)的方法在AAV血清型鉴定中的应用，它们可用于分析完整蛋白或VP的肽图谱，后者能够明确区分衣壳蛋白氨基酸序列，它在氨基酸序列水平上提供了高可信度的衣壳鉴别，这是目前区分VPs相对分子质量差异小于10D的血清型所必需的。

空壳率

空白衣壳比率的检测目前已经有qPCR法、光密度法、分析型超速离心（AUC）法和TEM法，但是这些方法中qPCR法会受到部分包封的衣壳的影响导致结果出现偏差；光密度法较为简便但是准确性不高；AUC法的操作较为复杂，检测耗时久；TEM法也无法区分部分包封的衣壳。

MS由于其较高的质量分辨率和质量检测范围，可以实现对AAV载体的完整衣壳蛋白、不同类型的VP蛋白、肽段和氨基酸序列的表征，使得MS在分析VP蛋白及其片段、PTMs和AAV载体血清型中有着独特的优势，并且检测需要的样品数量少、检测时间短，可以与不同的分离技术联用。

电荷检测质谱(CDMS)是一种单粒子方法，它同时测量单个离子的m/z和电荷(z)，以直接确定其相对分子质量。质谱法测量DNA和RNA的相对分子质量分布时，由于反离子的存在而导致异质性。非均质性反过来又限制了传统MS可以测量的寡核苷酸的大小，CDMS通过直接测量每个离子的质量电荷比(m/z)和电荷克服了这一限制。

总结和展望

质谱正在成为生物制药行业分析AAV基因治疗产品的关键表征技术之一。MS在分析AAV载体的衣壳比率、翻译后修饰、血清型、空壳率方面展现出了其独特的优势，不仅能在完整蛋白的水平上分析AAV载体，也能在肽段水平上分析AAV的衣壳。随着新的质谱电离技术和上游分离技术的发展，CDMS等先进技术将在AAV分析中发挥越来越重要的作用。MS仪器和数据分析软件的性能的增强，也能实现对于AAV组装规律的揭示、批次间的快速比较和高通量的载体质量检测。而将MS技术和众多的分离技术正交可以实现对于AAV蛋白质氨基酸序列的高分辨表征。未来随着AAV生产工艺和应用的发展，MS技术有望在生产过程的各个阶段实现对于AAV载体质量的实时监控。同时作为一种表征技术，可以用于指导AAV载体的设计过程。

参考文献：

李孟效,李惠琳.生物质谱技术在腺相关病毒（AAV）载体制剂质量控制中的应用[J].中国药科大学学报,2023,54(06):682-694.

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